В церкви работает художник Марио Каварадосси, рисующий Марию Магдалину. Прислуживающий ему ризничий с удивлением замечает в портрете сходство с незнакомкой, недавно молившейся здесь.
После ухода ризничего Анджелотти покидает своё укрытие и обращается к Каварадосси с просьбой о помощи. Но в это время появляется возлюбленная художника – певица Флория Тоска, – которая хочет договориться с ним о встрече после спектакля. Рассеянность Каварадосси настораживает Тоску. Заметив сходство Магдалины на портрете с маркизой Аттаванти, певица преисполняется ревностью и подозрениями в измене. Художнику с трудом удаётся успокоить любимую и уговорить её уйти.
Вернувшись к Анджелотти, Каварадосси предлагает ему приют в своём доме. В саду художника есть колодец, где можно спрятаться от погони. Каварадосси и Анджелотти покидают церковь через тайный ход.
Мгновение спустя в храм врываются полицейские, за ними – и барон Скарпиа. Они обыскивают капеллу Аттаванти в надежде найти следы беглеца. Шеф полиции допытывается у ризничего, не видел ли он Анджелотти. Испуганный служитель указывает на признаки того, что в капелле был посторонний: дверь в неё открыта, а корзина с завтраком пуста – тогда как Каварадосси отказался от еды. Скарпиа понимает, что художник помог Анджелотти бежать.
В церковь возвращается Тоска, мучимая ревностью. Барон решает воспользоваться её смятением. Он показывает певице веер с гербом Аттаванти, который Каварадосси в спешке обронил из свертка с женской одеждой, оставленного для Анджелотти. Скарпиа даёт Тоске понять, что художник ушёл с маркизой, и певица в отчаянии устремляется в дом Каварадосси, чтобы уличить его в измене.
План Скарпиа сработал. Тоска приведёт полицию к беглецу. Теперь Анджелотти обречён, но у барона есть ещё одна цель. Скарпиа должен отправить в тюрьму Каварадосси, и тогда Тоска – давняя страсть барона – окажется у него в руках.

Действие второе
Кабинет Скарпиа в Палаццо Фарнезе. Барон ждёт Тоску. Она должна прийти сразу после того, как споёт в торжественной кантате, прославляющей победу итальянской армии над Наполеоном. В кабинет входит Сполетта – подчинённый Скарпиа, посланный следить за певицей. Он сообщает, что Тоска действительно привела полицейских к Каварадосси и тот схвачен, однако Анджелотти найти не удалось.
Допрос Каварадосси не даёт результатов. Тоска, предупреждённая им, тоже не выдаёт Анджелотти. Барон приказывает пытать Каварадосси. Его стоны заставляют Тоску рассказать, где прячется беглец.
Торжествующий Скарпиа посылает за Анджелотти Сполетту. В этот момент жандарм Шарроне приносит известие: войска Наполеона разбили итальянских монархистов в битве при Моренго. Каварадосси не скрывает радости. Взбешённый Скарпиа отдаёт приказ заточить его в тюрьму.
Оставшись наедине с бароном, Тоска умоляет его освободить художника. Скарпиа обещает выполнить её просьбу, если певица подарит ему свою любовь. Тоска дает согласие: спасение Каварадосси для неё – превыше всего.
В присутствии Тоски Скарпиа приказывает вернувшемуся Сполетте во время казни стрелять в Каварадосси холостыми патронами. Барон обещает певице, что после ухода солдат она сможет бежать вместе со своим возлюбленным.
Сполетта удаляется. Скарпиа даёт Тоске пропуск, позволяющий беспрепятственно пересечь границу. Раскрыв объятия, барон приближается к певице. Тоска вонзает в его шею острую, длинную шпильку, нанося шефу полиции смертельный удар.

Действие третье
Тюрьма Сант-Анджело. Каварадосси ожидает казни. Он пишет прощальное письмо любимой и просит тюремщика передать его.
Вбегает Тоска. Показывая полученный от Скарпиа пропуск, она рассказывает художнику, что казнь будет мнимой. Услышав выстрел, Каварадосси должен упасть, а после того как солдаты удалятся, они вместе убегут. Успокаивая возлюбленную, измученную пережитым, Каварадосси старается в это поверить.
Появляется тюремщик: час казни наступил. Гремит залп – и Каварадосси падает. Тоска бросается к любимому, но её взывания тщетны. Художник мёртв. Обещание Скарпиа стрелять холостыми патронами оказалось ложью.
В тюремный двор врываются полицейские. Убийство барона Скарпиа раскрыто. Тоска не даёт себя схватить. Она бросается с крепостной башни.